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Des micropuces pour explorer l’architecture 3D des biomolécules

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La cristallographie est l’une des méthodes les plus utilisées pour observer l’architecture 3D des biomolécules (protéines, ARN, ADN). Or, l’étape la plus délicate de cette technique est la production de cristaux de la biomolécule dont on cherche à déterminer l’image 3D.
Une équipe de chercheurs français, en collaboration avec des collègues européens et 4 lignes de lumière, dont PROXIMA 2A à SOLEIL, a conçu une nouvelle puce microfluidique qui miniaturise et optimise la recherche de conditions de cristallisation. Elle permet en outre l’analyse directe des cristaux par cristallographie sérielle en exploitant les dernières innovations en matière de rayonnement synchrotron.
Leurs résultats ont été publiés en mai 2019 dans la revue IUCrJ.

La cristallographie joue un rôle central en biologie contemporaine parce qu’elle permet de visualiser l'architecture 3D des biomolécules – protéines et acides nucléique - et de comprendre leurs fonctions cellulaires à l'échelle atomique. Cette technique consiste à fabriquer des cristaux composés de la biomolécule étudiée, puis à analyser les propriétés de diffraction de ces cristaux sous rayons X, la plupart du temps grâce au rayonnement synchrotron, pour en déduire l’agencement dans l’espace des atomes qui composent cette biomolécule. En dépit des progrès réalisés en cristallographie au cours des dernières décennies, l’obtention de cristaux de qualité à partir d'une quantité limitée de biomolécules demeure le goulot d'étranglement de ce type d’études. Ce processus implique généralement un échantillonnage de l'espace chimique et physique par l’examen de centaines de cocktails composés de tampons à différents pH, de divers agents cristallisants - sels, alcools et polymères – et ce à différentes températures, pour identifier une condition favorable à la croissance de cristaux.

Suite à l'introduction il y a 15 ans des premiers systèmes microfluidiques dédiés au criblage à haut débit, le volume d'échantillon requis a été réduit à quelques (dizaines de) nanolitres par essai. La microfluidique a de ce fait été immédiatement considérée comme une percée majeure, en particulier par les biochimistes travaillant avec des échantillons difficiles à purifier en grande quantité, comme les grands complexes biologiques ou les protéines membranaires. Toutefois, malgré leur potentiel, ces technologies microfluidiques peinent à être adoptées par la communauté de croissance cristalline. Cela s'explique en partie par le coût de ces microsystèmes et des équipements associés, mais aussi par la difficulté d'extraire les cristaux fragiles des puces, ou par la nécessité de les reproduire en utilisant des méthodes de cristallisation classiques avant de pouvoir les soumettre à une analyse cristallographique.

Afin d'élargir l'attrait et la fonctionnalité des puces microfluidiques au-delà de la cristallisation et du criblage à haut débit, plusieurs équipes ont exploré la possibilité d'analyser les cristaux directement dans leur environnement microfluidique. Dans un article récent, une équipe française (CNRS – Université de Strasbourg) propose en collaboration avec des équipes de Grenoble, Marseille, Leipzig (DE), Granada (ES) et trois synchrotrons européens (SOLEIL, ESRF, SLS), une puce microfluidique polyvalente et peu coûteuse pour la production et la caractérisation de cristaux. Cette puce a été initialement conçue pour miniaturiser et faciliter l'identification des conditions de croissance cristalline par la méthode de contre-diffusion et son processus efficace d'auto-optimisation.

Figure : ChipX – un dispositif pour la cristallisation des biomolécules et l’analyse cristallographique sérielle. En haut à gauche, un schéma de la puce ChipX qui dispose de huit canaux de cristallisation. Au centre à gauche, un cristal de protéine obtenu dans un des canaux de la puce (bar d’échelle : 75 µm). En bas à gauche, ChipX lors d’une analyse des cristaux qu’elle contient sous rayonnement synchrotron (ici ligne PXIII, SLS, Suisse). À droite, un cliché de diffraction d’une série conduisant à l’image 3D de la protéine cristallisée (en bas à droite).

 

La dernière version de la puce, baptisée ChipX3, intègre plusieurs améliorations en termes d'injection de l'échantillon, de chargement des réservoirs et d’adaptation à l’analyse RX. Avec ChipX3, il est en effet possible de :

1) produire des cristaux, y compris par ensemencement,
2) les tremper in situ pour y introduire des ligands,
3) les visualiser par imagerie de fluorescence,
4) déterminer la structure 3D de la biomolécule qui les compose, par cristallographie sérielle à même la puce et à température ambiante.

Un véritable couteau suisse biocristallographique !