DISCO : Le poste d'imagerie de fluorescence UV

DISCO est une ligne de lumière de SOLEIL, qui utilise le rayonnement synchrotron dans le domaine ultraviolet. Dans cette vidéo, vous allez visiter l'une de ses trois stations expérimentales, le poste d'imagerie de fluorescence UV.

DISCO : Le poste d'imagerie de fluorescence UV

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DISCO est une ligne de lumière de SOLEIL qui utilise le rayonnement synchrotron dans le domaine ultraviolet. Nous allons visiter l'une de ses trois stations expérimentales, le poste d'imagerie de fluorescence UV. Le rayonnement traversera d'abord la chambre à miroirs, puis le monochromateur, avant d'aboutir au microscope.

La chambre à miroirs est le premier instrument d'optique rencontré. Deux miroirs mettent en forme le faisceau pour le focaliser sur la fente d'entrée du monochromateur. A ce stade le faisceau est polychromatique, c'est-à-dire qu'il contient plusieurs longueurs d'onde. On dit qu'il est blanc et c'est ainsi qu'il est représenté ici. Mais en réalité, il est invisible à l'œil nu.

Le monochromateur est un dispositif qui fournit une lumière monochromatique, d'une seule longueur d'onde. Celui-ci est un monochromateur dit "Czerny Turner". Il possède une fente d'entrée, une fente de sortie, deux miroirs et un réseau. Le faisceau est rendu parallèle par le premier miroir, puis diffracté par le réseau, enfin collecté par le second miroir qui le focalise sur la fente de sortie. Pour sélectionner la longueur d'onde désirée, on fait tourner le réseau. La rotation du réseau entraîne un déplacement du faisceau au niveau du second miroir et de la fente de sortie.

Ici, le faisceau lumineux sortant du monochromateur n'est plus constitué que d'une seule longueur d'onde ultraviolette.

Le faisceau est alors envoyé vers le microscope. Dans le microscope, il est réfléchi vers l'échantillon situé au-dessus par un miroir dichroïque. C'est un miroir qui ne réfléchit que les rayons lumineux inférieurs à une longueur d'onde donnée - ici l'UV - ce qui est important comme on va le voir plus loin.

Le faisceau est réfléchi sur l'échantillon et l’excite.

L'échantillon absorbe l'énergie des UV et la restitue partiellement sous forme de fluorescence de plus grande longueur d’onde. Les longueurs d’onde réémises sont caractéristiques des molécules d’intérêt. La fluorescence, le rayon vert ici, est collectée vers le bas, par le même objectif. Elle passe à travers le miroir dichroïque, puisque sa longueur d'onde est supérieure à la longueur d'onde d'excitation. Sous le miroir dichroïque, un miroir à 45° renvoie la lumière vers la caméra CCD. Des filtres sélectionnent la fluorescence UV que l'on souhaite imager. On descend jusqu'à 60 nm de résolution latérale et 200 nm de résolution axiale.

La ligne DISCO est dédiée à la chimie, la biochimie et la biologie cellulaire. Le rayonnement ultraviolet permet d'observer, en solution, les molécules présentes dans une cellule, une bactérie ou un tissu.

Prenons le cas des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques, en particulier les bactéries à Gram négatif MDR qui posent un réel problème de santé publique et peuvent provoquer des impasses thérapeutiques chez certains patients.

MDR= multidrug resistance

Cette résistance repose sur un complexe de protéines qui joue le rôle de transporteur et fonctionne comme une pompe, on appelle d'ailleurs ce système "pompe d'efflux", capable d'éjecter l'antibiotique hors de la bactérie grâce à un canal présent dans la membrane externe.

L'objectif est de trouver des inhibiteurs de pompe d'efflux ou des molécules moins reconnues par le transporteur. L’expérience utilise un antibiotique qui a la propriété de fluorescer lorsqu’il est excité par un faisceau UV.

Les images sont prises dans deux domaines, le visible en bas et les UV en haut.

- 1e temps : la bactérie est seule, il n'y a pas de fluorescence.

- 2è temps : on ajoute l'antibiotique, il n'y a toujours pas de fluorescence : l'antibiotique est en effet rejeté dans le milieu aussi vite qu’il a pénétré, puisque ce sont des bactéries MDR. Il est trop dilué pour que sa fluorescence soit observable.

- 3è temps : on ajoute le CCCP, une molécule connue qui dissipe l’énergie nécessaire à la pompe d'efflux. L'antibiotique n'est plus expulsé, il s’accumule dans les bactéries et l'on observe une fluorescence associée à ces bactéries.

On a ainsi une plateforme permettant de tester en temps réel des inhibiteurs de pompes d’efflux et, grâce aux performances de la ligne de lumière DISCO, d’observer précisément l’endroit où les molécules d’antibiotique sont localisées au sein de la bactérie.

Les chercheurs attendent beaucoup de cette méthode d’investigation qui apporte de nouvelles armes contre les infections bactériennes, une lutte toujours d’actualité.