La production d’agroaliments, de biocarburants ou de matériaux biosourcés peut impliquer la transformation de biomasse. Au niveau moléculaire, ce sont notamment les polymères de cellulose, un polysaccharide composant majeur de la matière végétale, qui sont transformés, via des réactions mettant en jeu des protéines, telles que des enzymes.
Pour comprendre ces phénomènes complexes, des scientifiques d’INRAE, de l’ESPCI et de la ligne DISCO de SOLEIL ont conçu une plateforme expérimentale permettant de visualiser des protéines dans un système cellulosique dense et organisé proche de ce qui existe dans la paroi cellulaire des plantes. Cette plateforme est une goutte de quelques microlitres contenant des nanoparticules de cellulose.
La biomasse peut répondre à plusieurs défis technologiques et sociétaux actuels, notamment le développement de biocarburants renouvelables, de « molécules plateformes » (briques de base pour la synthèse chimique d’autres molécules plus complexes) ou de nouvelles ressources alimentaires. Les avancées dans ce domaine reposent sur la compréhension des interactions polysaccharides-protéines. Par contre, les études se font le plus souvent en milieu dilué, qui ne reflète pas la composition de la matière végétale. Par conséquent, de nouvelles stratégies sont nécessaires pour étudier les protéines dans des conditions contraintes, c’est à dire dans des milieux hautement concentrés et organisés, à l’image des parois des cellules végétales. L'objectif de cette étude est de créer une plateforme expérimentale permettant de simuler l'organisation dense de la cellulose dans les parois cellulaires des plantes afin de suivre la localisation de protéines comme elles existent dans la biomasse, et ce pour des applications alimentaires ou des dégradations enzymatiques des parois végétales.
Les interactions cellulose-protéine ont été étudiées dans une suspension de nanocristaux de cellulose (CNC), une forme modèle de la cellulose. Entre autres propriétés, ces suspensions de nanocristaux sont connues pour s'auto-organiser en une phase cristal liquide appelée phase cholestérique, qui se rapproche de l'organisation des fibrilles de cellulose dans la paroi cellulaire des plantes (figure 1).
Figure 1 : schéma de la structure et composition de la paroi d’une cellule végétale (© LadyofHats, Creative Commons)
Cette structure de cristal liquide a été obtenue dans des gouttelettes de ces suspensions organisées qui ont ensuite été piégées dans un dispositif microfluidique ad hoc. Elles ont été utilisées pour étudier le comportement de deux protéines modèles : la sérum albumine bovine (BSA), une protéine modèle pour les systèmes alimentaires, connue pour ne pas réagir fortement avec la cellulose, et l’enzyme endo-glucanase GH7 qui, contrairement à la BSA, se lie aux molécules qu'elle dégrade -des polysaccharides, comme la cellulose- par l'intermédiaire de son module de liaison à ces polysaccharides.
Les gouttelettes de CNC organisées en phase cholestérique et la distribution des protéines ont été étudiées à l'aide du rayonnement synchrotron UV profond (DUV) sur la ligne DISCO. Le principe consiste à tirer parti de l'autofluorescence des protéines lorsqu’elles sont éclairées par le DUV, pour les localiser en microscopie UV sans perturber leur structure et leur activité.
Lorsqu’une molécule ou une particule d'intérêt est étudiée, il faut en général préalablement la marquer avec des groupements chimiques fluorescents de façon à pouvoir suivre sa localisation par microscopie. Cependant, ce marquage peut perturber l'activité de protéines sensibles telles que les enzymes. Sur la ligne DISCO, grâce à l’utilisation combinée du dispositif microfluidique et de la microscopie DUV, des gouttelettes entières de CNC ont pu être observées, au sein desquelles la BSA et la GH7 ont été localisées en temps réel grâce à leur autofluorescence. De plus, la microscopie à polarisation croisée a permis de caractériser l’état d'organisation de ces protéines dans les enveloppes cholestériques concentrées qui constituent les gouttelettes.
Il a ainsi été observé que les protéines étaient distribuées de manière homogène dans les volumes de gouttelettes, sans influence de l'état isotrope ou cholestérique de la cellulose ; cependant, l'organisation des CNC réagissait très différemment en fonction de la protéine (figure 2).
La BSA habituellement inerte a fortement perturbé l'organisation globale des gouttelettes en empêchant la formation d'un grand domaine cholestérique. La microscopie DUV a également révélé que la BSA était exclue des gouttelettes de CNC en continu pour diffuser dans des micelles de tensioactifs présentes autour des gouttes, constituant un « moteur micellaire », ce qui n'est pas le cas de la GH7. Si aucune quantification objective n'était possible, ces résultats mettent en évidence que des interactions polaires et de faible énergie se produisent entre la cellulose et la BSA, tandis que la GH7, qui interagit naturellement avec la cellulose via les modules de liaison, a conservé sa structure 3D inchangée.
Figure 2 : Images composites obtenues par microscopie DUV de gouttelettes de CNC + protéine GH7 ou BSA. En vert : autofluorescence émise par les protéines GH7 ou BSA. En rouge : biréfringence caractéristique de l’auto-organisation des CNC. À gauche, gouttelette CNC + GH7 ; au centre : après un temps de repos suffisant, on observe les CNC auto-organisés dans une gouttelette GH7+CNC. À droite : CNC + BSA, qui a diffusé dans les micelles autour de la gouttelette restant désorganisée.
Ces résultats démontrent comment les protéines peuvent se comporter dans des environnements cellulosiques densément organisés, et inversement l'impact d'un tel environnement sur le comportement des protéines. Ce travail peut être utilisé pour diverses applications biologiques telles que l'étude de l'action enzymatique sur la biomasse au cours du biotraitement, l'étude des interactions protéines-polysaccharides dans les matériaux biosourcés innovants, ou la compréhension de la digestion dans divers processus alimentaires.
Dans des travaux ultérieurs, la proportion de domaines ordonnés CNC sera modulée et le système complexifié. En particulier, d’autres biopolymères tels que des hémicelluloses seront ajoutés afin de reproduire plus fidèlement la composition et la structure de la paroi cellulaire des plantes et d'évaluer leur influence sur le comportement protéine des enzymes.